C18色譜柱具備的孔徑，改進的選擇性、吞吐量、靈敏度及鍵合能力非常適合生物分子的分離分析。適合用于親水性更強的蛋白質(zhì)分離。
C18色譜柱的pH環(huán)境選擇：
對于傳統(tǒng)pH值使用范圍通常為2～7，因為pH值高于8時C18固定相會受到限制。由于殘余硅羥基的存在，易對堿性化合物造成不可逆吸附，造成峰拖尾，影響分離與分析。pH值太低則會使鍵合的烷基脫落，而且對成分的分離達不到要求。
1、堿性條件下C18的選擇
制造快速分離堿性化合物的化學鍵合相一直是研究熱點。
雙齒鍵合固定相的每個硅烷化分子中含有兩個硅原子，兩個硅原子之間以-O-或-CH2-CH2等基團連接，每個硅原子含有1個C18官能團。它的環(huán)狀結(jié)構(gòu)無論在低pH值條件下，還是高pH值條件下均顯示了較高的穩(wěn)定性和滿意的柱效。
與傳統(tǒng)的單齒化學鍵合相相比，這種化學鍵合固定相突出的優(yōu)點是在低、中、高pH值時都有很好的穩(wěn)定性。
在開發(fā)普魯卡因有關物質(zhì)的藥物分析方法中，對比8種色譜柱，選擇了耐受pH值范圍較大的色譜柱。分析樣品與雜質(zhì)均為堿性，使用C18使各雜質(zhì)與組分間分離較佳。若堿性物質(zhì)間的分離效果不佳，可以考慮使用上述鍵合相填料。
2、酸性條件下C18的選擇
為了改善色譜柱在低pH值時的穩(wěn)定性，有人提出了空間位阻方法。
空間位阻作用是指連接較大基團，立體阻礙溶質(zhì)基團進攻硅醇基，使硅氧烷能夠再生，提高了化學鍵合固定相抗水解的能力。
還有人制備了側(cè)鏈中含有異丙基或異丁基的C18化學鍵合固定相。該固定相由于引入了較大的側(cè)鏈基團，立體阻礙了殘留硅醇基與溶質(zhì)之間的相互作用，在低pH值條件下能夠保持穩(wěn)定，這種化學鍵合固定相更適合酸性物質(zhì)的分離。
C18色譜柱就使用了空間位阻技術，其使用單官能團硅烷，具有較大的二異丁基側(cè)鏈基團，空間位阻關鍵的硅氧烷鍵合到硅膠表面，以避免在低pH值條件下水解破壞，在酸性流動相條件下提供良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。因此，StableBond色譜柱成為低pH值方法開發(fā)的優(yōu)選。在方法開發(fā)初期，若選定流動相為酸性，可將此類色譜柱作為優(yōu)選。
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